產(chǎn)品規(guī)格
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Cell Counting Kit-8 簡(jiǎn)稱 CCK-8 試劑盒,是一種基于WST-8(化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。
WST-8屬于MTT的升級(jí)產(chǎn)品,工作原理為:在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物(formazan)。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比,與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值,間接反映活細(xì)胞數(shù)量。
CCK-8法應(yīng)用非常廣泛,如藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)以及生物因子的活性檢測(cè)等。
產(chǎn)品特點(diǎn)
檢測(cè)液呈淡黃色,加入培養(yǎng)基后可以明顯看到顏色變化,避免漏加或者多加檢測(cè)液;
檢測(cè)液的穩(wěn)定性較好,較高溫度保存或運(yùn)輸不易變質(zhì);
提供了更高的檢測(cè)靈敏度,檢測(cè)范圍比過往試劑盒更寬。
保存條件
冰袋運(yùn)輸,2-8℃避光保存一年有效,-20℃避光保存兩年有效。
使用說明
一. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(測(cè)定細(xì)胞具體數(shù)量)
1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量,然后接種細(xì)胞到培養(yǎng)板內(nèi)。
2、按比例(例如:1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度,一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度,每個(gè)濃度建議3-6個(gè)復(fù)孔。
3、接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁,然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD值,制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸),OD值為縱坐標(biāo)(Y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致,便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。)
二. 細(xì)胞活性檢測(cè)
1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μL/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間(37℃,5% CO2)。
2、向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-2小時(shí)。
4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。
5、若暫時(shí)不測(cè)定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定,吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
三. 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)
1、在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(37℃,5% CO2)。
2、向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如:6、12、24或48小時(shí))。
4、向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要再孔中生成氣泡,它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。
5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
6、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。
7、若暫時(shí)不測(cè)定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定,吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
注意:如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話,可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基(除去培養(yǎng)基,并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次,然后加入新的培養(yǎng)基),去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養(yǎng)基,直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
活力計(jì)算
細(xì)胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)] ×100
A(加藥):具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度
A(0加藥):具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細(xì)胞活力:細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力
注意事項(xiàng)
1. 建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。
2. 有條件的情況下建議采用多通道移液器,可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時(shí),建議斜貼著培養(yǎng)板壁加,不要插到培養(yǎng)基液面下加,容易產(chǎn)生氣泡,會(huì)干擾OD值讀數(shù)。
3. 白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。
4. 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí),貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低,因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn),請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量,并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。
5. 如果沒有450 nm的濾光片,可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片,但是450 nm濾光片的檢測(cè)靈敏度最高。
6. 培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí),通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。
7. 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
8. 本產(chǎn)品僅供科研使用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)!